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固相萃取—液相色譜法測定養殖水體中磺胺類抗生素
養殖水體是水生生物的集聚場所，具有生物密度高、組成多樣、水色深、顆粒懸濁物多、抗生素藥物組成復雜等特點。水中抗生素的存在會直接引發水產品藥物殘留量標事件，給人們的健康帶來極大的隱患，同時也嚴重影響我國水產品進出口貿易的發展[1]。目前，對水體中抗生素藥物的處理能力十分有限，大多采用吸附凈化[2]、化學處理[3]與UV輻照[4]等方法，但上述方法受到水體容量、經濟成本、環境影響等因素的限制難以廣泛推廣。
根據養殖水體特點，常用的水樣前處理技術有固相萃取[5]、液液萃取[6]、分散液液微萃取[7]等。相較于其他方法，固相萃取具有簡單、快捷、富集與凈化能力強等特點，已較好應用于水樣中抗生素[8]與農藥[9]的測定。該研究將固相萃取技術和液相色譜法串聯起來，建立了養殖水體中磺胺類的測定方法，用以解決磺胺類部分組分回收率低以及液相色譜儀樣品分析時間過長等問題。
1 材料與方法
1.1 試驗材料
1.1.1 主要儀器和試劑 儀器耗材：ACQuity型液相色譜儀 （PDA檢測器，美國Waters公司），20-SPE型固相萃取裝置（美國Agilent公司），ODS-C18柱，PEP柱，PLEXA PCX柱，PRS柱。藥品試劑：乙腈（色譜純），乙酸乙酯（色譜純），二氯甲烷（色譜純），環己烷（色譜純），甲醇（色譜純），氯化鈉（分析純），2%乙酸緩沖液。1.1.2 標準物質 磺胺嘧啶（SD）、磺胺噻唑（ST）、磺胺甲基嘧啶（SM1）、磺胺二甲基嘧啶（SM2）、磺胺甲基異噁唑（SMZ）、磺胺多辛（SDM）、磺胺異噁唑（SIZ）、磺胺喹噁啉（SQ）均購于國家標準物質研究中心，純度均大于98.0%。
1.2 試驗方法
1.2.1 樣品采集、預處理 分別采集多個代表性的池塘養殖用水，用5 L清潔的玻璃瓶混勻后低溫保存。試驗前將水樣用溶劑過濾器過濾。
1.2.2 固相萃取條件優化 （1）pH值。由于磺胺類藥物在不同酸堿度條件下其結構存在較大差異，在經過多種組合比較后，分別將水樣pH值調節為4.5、6.0、7.0、8.0、10.0，比較不同pH值條件下水樣中磺胺類藥物的提取率。（2）提取液。根據養殖水體中磺胺類抗生素的特性，分別選取提取液Ⅰ（乙腈+乙酸乙酯=20+40 mL）和提取液Ⅱ（乙腈+二氯甲烷=20+40 mL）作為提取溶劑，比較兩種提取液的萃取效果。（3）氯化鈉用量。取3份100 mL水樣，分別添加0、5、10 g氯化鈉，加入一定量混合標準溶液，比較不同氯化鈉添加量對水樣中磺胺類藥物添加回收率的影響。（4）萃取柱。分別采用PEP柱、Plexa柱、ODS-C18柱、PRS柱4款凈化柱進行萃取試驗，比較不同萃取柱對水樣中磺胺類藥物的回收效果。
1.2.3 樣品處理 量取100 mL待測水樣，調節pH值，轉移至250 mL分液漏斗中，添加提取液和氯化鈉，混搖2 min，靜置分層；用雞心瓶收集下層有機混合相；再加入提取液重復提取1次，合并兩次的萃取液，于40℃旋轉蒸發至近干，用5 mL甲醇溶液（5%）溶解瓶內殘留物。以5 mL的甲醇活化萃取柱，將樣液轉移至柱中，用3 mL甲醇溶液復溶瓶內殘留物，液體一并轉移至柱中；整個固相萃取過程流速控制在1 mL/min，待柱內近干時用15 mL甲醇洗脫串聯柱；洗脫液于40℃旋轉蒸發至干，用流動相溶解過濾，待液相色譜檢測。
1.2.4 色譜檢測條件 色譜柱：BEH–C18柱（150 mm×4.6 mm，2.1 ?m）；檢測波長：270 nm；色譜柱溫：35℃；進樣體積：10 ?L。流動相梯度洗脫條件見表1。
1.2.5 方法鑒定 以優固相萃取條件對8種磺胺類藥物的混合標準溶液進行測定分析，考察方法的檢出限和精密度。
1.2.6 方法應用 采集了長沙地區網箱養殖基地、池塘養殖基地、無公害養殖池塘3種不同類型養殖水域的4個水樣，按該研究建立的方法進行檢測分析。
2 結果與討論
2.1 pH值的確定
由表2可知，磺胺二甲基嘧啶在pH值為4.5時提取率高，磺胺喹噁啉在pH值為6.0和10.0時均有較高的提取率，其余6種磺胺物質提取的適pH值均為6.0。因此，綜合考慮以6.0作為試驗水樣的提取pH值，水樣中各磺胺類藥物的提取率均在60%以上。
2.2 提取液的選擇
對比兩種提取液發現，提取液Ⅰ中乙酸乙酯會出現在液體的上層影響提取液的收集，同時由于乙酸乙酯只能從乙腈與水樣的混合液中反萃取少量的乙腈也影響提取效率；而采用提取液Ⅱ進行提取時，二氯甲烷能從乙腈水溶液中反萃取乙腈后出現在液體的下層，方便萃取液的收集和再次萃取，樣品分析圖譜中無溶劑峰和基質干擾峰影響，提取效率較高。故而選用乙腈+二氯甲烷作為前處理的佳提取液。使用時，先添加20 mL乙腈，與水樣混勻，再加入20 mL二氯甲烷，萃取1次之后，再加入20 mL二氯甲烷重復提取1次；合并兩次萃取液，進行下一步操作。
2.3 氯化鈉用量選擇
Cu2+、Fe3+、Zn2+、Mg2+等金屬離子存在時會影響目標化合物的回收率，而適量的Cl-能結合部分金屬離子，有利于提高樣品的回收率。結果顯示，不添加氯化鈉時，二氯甲烷層會出現渾濁，樣品的回收率為20.3%～40.2%；添加5 g氯化鈉時，二氯甲烷與乙腈混合液和水相分層清晰，有機相透亮，樣品的回收率為70.6%～90.4%；添加10 g氯化鈉時，高濃度的鹽溶液與有機相分界面上出現少量的氯化鈉顆粒物，且上層的水相與分液漏斗接觸面會形成的氣泡影響分層效果及回收率，試驗回收率僅在65%上下。因此，添加5 g氯化鈉為適宜。
2.4 固相萃取柱的選擇
磺胺類化合物大多為弱極性， PEP柱、Plexa柱、ODS-C18柱、PRS柱4款凈化柱均有一定富集能力。從表3中可以看出，磺胺噻唑和磺胺喹噁啉采用PEP柱凈化時回收效率高，其他6種磺胺類藥物的凈化效果均以ODS-C18柱的，回收率在61%以上。因此，選用PEP與ODS-C18串聯柱形式進行樣品凈化效果，如圖1所示，減少了樣品基質的干擾，提高了方法的靈敏度，回收。
2.5 標準曲線的制作、檢出限、精密度及回收率
從表4中可以看出，8種磺胺類藥物的檢出限為0.01～0.03 mg/L。方法的精密度、回收率試驗結果如表5所示，采用試驗優化的方法進行測定，8種磺胺類藥物的平均回收率為73%，平均相對標準偏差（RSD）為4.24%，能滿足實驗室對養殖水體磺胺類殘留物檢測技術的要求。
2.6 水和土壤環境樣品的測定
由表6可知，不同區域養殖水域內磺胺類抗生素的總含量在0.25～20.26 mg/L之間，由高到低排序依次為池塘養殖基地>無公害養殖池塘>網箱養殖基地2>網箱養殖基地1。這樣的結果與養殖水域的面積、餌料用量、養殖密度、水體交換與自凈能力等因素有關。普通池塘養殖基地因施用含抗生素的餌料和藥物，使水樣中抗生素含量較高；無公害養殖池塘能規范餌料與藥物的用量，較好地控制了水體中抗生素的含量。網箱養殖基地不以單一的投喂方式作為餌料來源，自然供給也能為養殖生物提供食物補充；同時，由于單位面積內水體的交換頻率高、物種密度低、治療類抗生素用量少，所以水體中抗生素含量較低；其中，網箱養殖基地1較網箱養殖基地2水域面積更大、自然水源補給更充裕，故其水體中抗生素含量更低。3 結 論
研究建立了養殖水體中8種磺胺類抗生素殘留物的液相色譜檢測方法。實踐表明，該方法簡便可行、快速、回收率較高，能滿足實驗室對養殖水體磺胺類殘留物新檢測技術的要求。
采用固相萃取-液相色譜法測定養殖水體中8種磺胺類殘留量，以乙腈-二氯甲烷為提取劑，提取后殘留雜質較少，提取效率高；以PEP柱與ODS-C18柱進行富集凈化，有效地提高了磺胺類藥物檢測方法的靈敏度，除磺胺甲基異噁唑與磺胺多辛未*分離外，其余組分均較好地分離，樣品圖譜峰形對稱，組分重現性好；調節pH值至6.0，引入氯化鈉增強液液萃取效率，極大地促進了樣品的處理效果。該方法中8種磺胺類抗生素的添加回收率為60.0%～89.0%，檢出限為0.01～0.03 mg/L，適用于養殖水體中磺胺類藥物多組分殘留的分析測定。
